全国统一服务热线:

400-808-7372

加入收藏
浏览全部产品分类
发布日期:2021/9/13 14:19:00

一、蛋白样品制备

之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取,当我们做WB的时候,需要对提取好的蛋白样品进行处理:在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X(蛋白上样缓冲液)稀释至1X(如蛋白样品有120ul,则加入SDS loading buffer 6X 600ul),混匀,75-95度加热10-15分钟,使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后,进行离心,使蛋白样品适当降温,防止PAGE胶被融化。

PS:要测量的蛋白如果是磷酸化形式,一般加热到75度,一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的,最后稀释至1X即可。

那么为什么我们加入SDS loading buffer呢?主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。

SDS loading buffer 的主要成分及作用:A:0.1%溴酚蓝,作为指示剂,方便观察电泳进行的程度;B:10%甘油,密度大,增加样本的重量,可携带样本沉到底部;C:2%SDS,是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物,是蛋白质带满负电荷,从而是蛋白带电荷一致,减少电荷对电泳结果的影响;D:巯基乙醇还原剂,使蛋白质的二硫键断开,使得蛋白保持线性结构。

二、蛋白上样

1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上,加入1X电泳液

2. 拔出梳子,应该两侧同时用力,缓慢拔出,注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形,若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正。

3.加入蛋白样品,一般10孔的梳孔,每孔可以加入20ul  -40ul蛋白样品,15孔的梳孔,每孔可以加入10ul  -30ul蛋白样品,是用微量注射器加样,平时我们也可以用普通的移液枪加样,尽量让枪头深入梳孔底物,防止蛋白样品飘出,一般在目的蛋白两侧加入等量的marker,如果两侧有空的梳孔,应该加入1X的loading buffer,起“压边”作用,可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。

4.电泳:接上电极,正负极不要弄反,红色对红色,黑色对黑色,初始电压设为90V,当样品跑至分离胶时将电压调至120V,一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳,也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间,如分子量较大,可以延长电泳时间,使得分子量大的marker跑的分散开,容易判断分子量。

三、注意事项

1.蛋白样品上样量最好相等,不要过多。2.不要过多重复使用电泳Buffer3.最佳分辨区在分离胶的2/3;4.电泳后测定的分子量有10%的误差,不可完全信任。有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上的肽链(α-胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链,SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量,有的蛋白质(如电荷异常或结构异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质)不能采用该发测相对分子量。5.如果电泳中出现拖尾,染色带的背景不清晰等现象,可能是SDS不纯引起。

来源:上海远慕生物科技有限公司

上一篇:单细胞测序前期常见问题解答
下一篇:配制培养基的各项要求

标准物质中心_北京谱析标准技术有限公司  版权所有_京ICP备17056642号-1