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发布日期:2021/9/13 13:53:00

  1. 为什么要做单细胞测序?

细胞与细胞之间的异质性,微环境里的细微差别,这些我们关注的信息都会被常规Bulk测序所掩盖,而单细胞水平可以将细胞一一分开,找到差异。单细胞测序shou次将我们的研究抛开上帝视角,深入到细胞内部,观察每一个细胞的差别和相似,除了基因层面,我们也可以在细胞层面和细胞类群层面进行多维度的解析。

2、单细胞测序对送样有什么要求?

制备好的单细胞悬液或血液、组织均可,质量要求:细胞活性大于80%,细胞浓度介于5*10^5—1.2*10^6/ml,细胞总数最好大于10^5个,细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+,细胞体积需小于40μm,大于5μm。不同物种、不同组织,包含的细胞类型多种多样。针对同一个组织,根据研究的生物学问题,对不同细胞类别的需求也是千差万别。派森诺的单细胞悬液制备研发团队,针对不同的物种、不同的组织类型、不同的实验处理方式、不同的感兴趣的细胞类型设计一对一高度个性化的解离方案。取样细节、运输细节,方方面面,为您高度个性化的研究保驾护航。

3、细胞悬液的制备过程中是否会影响基因的表达?

目前常用的方法中,不管是酶消化还是机械操作都会不可避免的对细胞产生影响,前者会使细胞产生应激反应,后者则容易损伤细胞,进而影响细胞活性。所以,在单细胞测序实验设计时,设置对照是非常重要的。前述的这些影响,在case和control中同样存在,我们关注case和control的差异表达基因,就可以去除实验的系统误差,找到决定感兴趣生物学过程的关键基因。

4.、10XGenomics单细胞平台有什么优势?

一.细胞通量高,一次可捕获上万细胞 ;二.对细胞大小及类型限制低,且捕获效率高达65% ;三.性价比高,且从悬液到文库构建周期短。

5、如何判定数据质量?

拿到一个高质量的数据,第一步是需要获得高质量的单细胞悬液。单细胞悬液的细胞活性,要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和台盼蓝染色法。相比较而言,台盼蓝染色会有一定的假阴性。针对用台盼蓝染色做的植物原生质体的活性测定,假阴性的比例会更高。因为富含叶绿体的植物细胞在台盼蓝染色后颜色更深,细胞计数仪会被判定为死细胞。因此,经验丰富的操作人员检查细胞状态,也是非常重要的一步。第二步是需要捕获到足够数量的高质量的细胞。关于这一点的质控标准,可结合下图做个阐释。

1、捕获到的细胞数量:这是单细胞测序研究的重要参数。捕获到的细胞数量越多,证据越充分,越有利于发表高分文章。在后续分析过程中,会再做一次细胞过滤,最终得到的细胞数目,即是每一篇单细胞测序文章都会描述的捕获到的细胞数目。

2、是细胞中的平均reads数,相当于测序深度,一般大于3万是比较好的数据。

3、是细胞中的中位基因值,该值的大小与不同的组织样本有关,如癌细胞中可能数值较高。

4、是测序的饱和度,一般大于50%即可。

5、是本次测序得到的reads比对到高质量细胞的占比,也是后续用来分析的数据。如果细胞活性偏低,细胞破裂较多,游离到环境中的mRNA偏多,这个数值会偏低。

6、如何判断细胞类型?

细胞类型的判断是需要您自己选择Marker基因的,您可以参考同类物种或样本的已发表文章,或者根据数据库去确定Marker,比如CellMarker,panglao等。

细胞是生命活动的基本单位,而如今科技的发展让我们有能力有机会去对它进行探索,去一展它的全貌,去窥探复杂生命背后的深层机制,我们相信在未来较长的一段时间内,随着单细胞测序的发展及数据的积累,关于表型、基因型与环境之间的脉络会越来越清晰,让我们能更加深入的了解自然了解自己。

来源:昆山远慕生物科技有限公司

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