固相化学衍生化法
前面所述的衍生化反应都是液 - 液反应的方式,操作起来比较繁琐、费时,而且需要一些进行微量有机合成的小型装置。同时,由于反应后过量的衍生化试剂存在,对下一步的色谱分析形成干扰,有时还需要进行进一步的分离。这些都增加了色谱分析的成本和时间。为了改进衍生化方法,使之使用更加方便、快捷,有人以硅胶或高分子小球为基体,在其表面结合一种反应剂,然后填装在短管内,当样品液通过反应管时就可以发生各种化学反应,包括还原、氧化、基团转移和催化等。下面分别介绍几种固相反应剂。
(1)还原型固相反应剂
这类固相化学衍生反应可以避免液相衍生化反应给色谱分析带来的不足,可以将衍生化小柱直接与色谱仪器的进样器联接,经过小柱的样品可直接进入色谱仪器进行分析。这实际上是将固相有机合成反应移植到色谱分析中来。
另一类固相化学衍生剂是固定化酶反应器。酶是一种具有特殊三度空间构象的蛋白质,能够催化某一底物进行特异性化学反应,生成特定的反应产物。酶的催化反应具有高度的专一性,酶试剂通常在反应中是不消失的。酶的固定化使得一次性应用的酶试剂变为可重复使用。酶的固定化可分为化学和物理两种方法,化学法是指在酶和载体之间生成共价键,并保留其生物活性,而物理方法仅是吸附在固体表面。对载体的要求是对酶应有较高的亲和力和较大的容量,且容易再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大,而容量越大,固定化酶的活性越高,寿命越长。硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。例如纤维素或葡聚糖凝胶与溴化氰反应,然后用酶处理
酶一旦被固定,其稳定性增加。利用酶反应的专一性完成的衍生化反应,可以改变底物的化学特性,提高色谱分析的灵敏度和选择性。图 10-2-54 给出了固定化酶反应器的结构示意图。