一、微量凯氏(kjeldahl)定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

 NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)

 2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)

 (NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)

反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。

 二、双缩脲法(biuret法)

 (一)实验原理

 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

 (二)试剂与器材

 1.试剂：

 (1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05NaOH配制。

 (2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O)，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

 2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

(三)操作方法

1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20～25℃)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

 三、folin―酚试剂法(lowry法)

 (一)实验原理

 这种蛋白质测定法是最灵min的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购)，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

 这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

 folin―酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

 对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%)，硫酸纳(1%)，硝酸纳(1%)，三lv乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙mi(5%)，丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠―氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠―氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

 进行测定时，加folin―酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜―蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸―磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

 此法可检测的蕞低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

 (二)试剂与器材

 1.试剂

 (1)试剂甲：(a)10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。(b)0.5克硫酸铜(CuSO4•5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份(a)与1份(b)混合，即为试剂甲。

 (2)试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4•2H2O),25克钼酸钠(Na2MOO4•2H2O)及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4)，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

 (3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g―球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。

 2.器材

(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管16支

 (三)操作方法

1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温(20～25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(folin―酚试剂)，同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。

 2.样品的测定：取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克)，按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

 注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。

 四、改良的简易folin―酚试剂法

 (一)试剂

1.试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

 2.试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

 3.标准蛋白质溶液：同基本法。

(二)操作步骤

 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与folin―酚试剂法(即lowry基本法)相接近的结果。

五、考马斯亮兰法(bradford法)

(一)实验原理

双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

(二)试剂与器材

 1.试剂：(1)标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。(2)考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

 2.器材：(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管16支

(三)操作方法

1.标准方法：(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。(2)加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

 2.微量法

 当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O,考马斯亮蓝g-250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。

 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

 六、紫外吸收法

 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化，因此要注意溶液的ph值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的ph相一致。

        来源：上海远慕生物科技有限公司